Количественная ПЦР: принцип, область применения в лабораторной практике

Сегодня одной из актуальных проблем современной медицины является эффективная диагностика разнообразных заболеваний. Для решения данной проблемы в медицине разрабатываются и используются различные диагностические методы. Одним из самых популярных диагностических методов является полимерная цепная реакция (ПЦР).[1] Данный метод был открыт еще в 1983 году и за это время зарекомендовал себя в качестве наиболее точного способа выявления инфекции.

С момента открытия ПЦР появилось множество ее модификаций, многократно увеличивших возможности изначального метода. К таким модификациям относятся: ПЦР in situ,  мультипраймерная ПЦР, количественная ПЦР (ПЦР в реальном времени) и др. Сегодня в повседневную лабораторную практику наиболее прочно вошла ПЦР в реальном времени (Real-time PCR). Данная модификация максимально раскрывает потенциал методики ПЦР, при этом ежедневно увеличивая спектр своего применения.[2]

В связи с вышесказанным, актуальность исследования принципов количественной ПЦР и сферы ее применения не вызывает сомнения.

Цель данной работы заключается в исследовании принципов и области применения количественной ПЦР.

Исходя из цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Рассмотреть понятие ПЦР;
2. Рассмотреть принципы количественной ПЦР;
3. Изучить стадии постановки ПЦР в реальном времени;
4. Выявить достоинства ПЦР в реальном времени;
5. Исследовать область применения количественной ПЦР в лабораторной практике.

При исследовании были использованы методы: общенаучные такие как анализ научной литературы, систематизация, и  эмпирические, такие как наблюдение.

ГЛАВА 1.  ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР

1.1. Понятие и модификации ПЦР

Метод ПЦР, сделавший большой прорыв в молекулярной биологии, был опубликован и запатентован К.Б. Мюллисом в 1983 г.

Рассмотрим что же такое ПЦР.

ПЦР является экспериментальным методом молекулярной биологии, дающим возможность существенно увеличить концентрацию конкретных участков нуклеиновой кислоты в биологической пробе.[3] Суть метода заключается в ферментативном синтезе фрагмента дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с заданной нуклеотидной последовательностью.[4]

В настоящее время существует множество модификаций ПЦР. Представим наиболее распространенные из них:

1. ПЦР с горячим стартом или hot-start PCR. Данная модификация метода направлена на предотвращение неспецифического взаимодействия компонентов реакционной смеси до достижения оптимальных условий амплификации. При проведении ПЦР с «горячим» стартом вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР минимизируется, вследствие чего также становятся минимальны ложноположительные результаты анализа.
2. ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR). Данная методика предназначена для идентификации известной последовательности РНК. Суть реакции – синтез двухцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК. Для этого вначале необходимо в реакции обратной транскрипции превратить одноцепочечную молекулу РНК в комплементарную ДНК (кДНК) и далее амплифицируют уже ДНК-матрицу. ОТ-ПЦР широко используется для выявления вирусов, геном которых представлен РНК (ВИЧ, гепатит С, вирусы гриппа и другие), в качестве индикатора экспрессии определенных генов в клетке или ткани с целью диагностики генетического заболевания и полуколичественного определения специфических молекул РНК (рис. 1).

Рисунок 1 – Принцип ОТ-ПЦР

3. Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР. Данная методика представляет собой одновременную амплификацию нескольких искомых последовательностей ДНК, происходящую в одной пробирке. Каждая пара праймеров для мультиплексной ПЦР должна обладать строгой специфичностью по отношению к соответствующей искомой мишени, а условия циклирования должны обеспечивать равноэффективный отжиг всех участвующих в реакции пар праймеров, чтобы выход амплифицируемых продуктов был по возможности одинаковым. Преимущество данной методики: возможность проведения скрининговых исследований с минимальными затратами на расходные материалы. Кроме того, из одного образца можно получить максимум информации в рамках одной постановки ПЦР.
4. Гнездовая (nested PCR) ПЦР. Данную модификацию используют для уменьшения количества побочных продуктов реакции. С этой целью проводятся две применяются последовательные реакции с использованием двух пар праймеров, причем второй парой праймеров амплифицируется фрагмент ДНК, находящийся внутри продукта первой реакции.
5. ПЦР инвертированная. Этот метод применяют когда внутри необходимой последовательности известен только небольшой участок.
6. Асимметричная ПЦР. Методику используют в случае необходимости амплифицирования преимущественно одной из цепей исходной ДНК. Отличием от стандартной ПЦР является то, что для реакции берется большой избыток одного из праймеров.
7. ПЦР длинных фрагментов (long-range, PCR). Данная модификация предназначена для амплификации больших участков ДНК. В методике используется смесь двух полимераз: Taq-полимеразы, которая характеризуется высокой процессивностью и способна за один проход произвести синтез длинной цепи ДНК; Pfu-полимеразы, которая обладает с 3'-5'- экзонуклеазной активностью и необходима для удаления некомплементарных нуклеотидов.
8. Технология NASBA (от англ. Nucleic acid sequence based amplification). Основу методики составляет амплификация молекул РНК возбудителей заболеваний при участии ферментов: обратной транскриптазы, РНК-полимеразы и РНКазы, двух пар специфических праймеров. Выбор РНК в качестве искомой мишени связан с тем, что данная нуклеиновая кислота выделяется только из живых клеток и быстро разрушается после их гибели. Технология NASBA отличается от ОТ-ПЦР тем, что искомая РНК в процессе амплификации не только является основой для получения кДНК, но и основным объектом накопления и детекции.
9. ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR, ПЦР-РВ, количественная ПЦР). Данную модификацию применяют с целью одновременной амплификации, детекции и (при необходимости) измерения количества искомой мишени. Преимущество данной методики - возможность количественно определить специфическую последовательность НК в пробе после каждого цикла амплификации

1. Диагностика методом ПЦР: современный подход выявления инфекционных и генетических заболеваний [электронный ресурс] // Режим доступа: https://www.kp.ru/guide/diagnostika-metodom-ptsr.html. Дата обращения: 12.10.2019.
2. Екимов А. Н., Шипулин Г. А. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) [электронный ресурс] // Режим доступа: http://www.pcr.ru/bibliogr/articles/article_18.htm. Дата обращения: 12.10.19 г.
3. Зверев В.В. Основы микробиологии и иммунологии : учебник / Под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2016. - 368 с.
4. Зорина В.В. Основы полимеразной цепной реакции: Методическое пособие. [электронный ресурс] // Режим доступа: https://www.dna-technology.ru/sites/default/files/pcr_a5_083-4.pdf. Дата обращения: 12.10.19 г.
5. Количественная ПЦР: суть анализа и расшифровка результатов [электронный ресурс] // Режим доступа: https://fb.ru/article/422053/kolichestvennaya-ptsr-sut-analiza-i-rasshifrovka-rezultatov. Дата обращения: 12.10.2019.
6. Лопухов Л.В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике.      Лабораторная        диагностика / Л.В. Лопухов, М.В. Эйдельштейн // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – Т. 2. – № 3. – С. 96-106.
7. Орадова А.Ш. Полимеразная цепная реакция в лабораторной диагностике // Вестник КазНМУ. – 2013. – №4-1. – С. 307-311.
8. Перенков А.Д., Новиков Д.В., Фомина С.Г. Пособие к практическим занятиям по молекулярной  биологии. Часть 2. Методы молекулярной диагностики: Учебно-методическое пособие. – Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет им. И.Н. Лобачевского, 2015. – 44 с.
9. Ребриков Д. В. ПЦР в реальном времени / под ред. д. б. н. Д. В. Ребрикова. — 7-е изд. — М. : Лаборатория знаний, 2018. — 223 с.
10. Руководство по ПЦР в реальном времени для начинающих [электронный ресурс] // Режим доступа: https://vmtechnology.ru/pcr-simple/.  Дата обращения: 12.10.2019.
11. Сальникова Е.А., Тарасова Е.Е. Преимущества метода ПЦР в реальном времени // В сборнике: Сахаровские чтения 2017 года: экологические проблемы XXI века материалы 17-й международной научной конференции. В 2-х частях. Под общей редакцией С.А. Маскевича, С.С. Позняка. – 2017. – С. 213-214.
12. Семенихина А.В., Рахманова Т.И., Нехаева Г.И., Попова Т.Н. Современные методы микробиологических исследований: Учебно-методическое пособие для вузов. // Воронеж: Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2007. – 68 с.
13. Суворова А.О. Микрочиповая аналитическая система для обнаружения рибонуклеиновых кислот с помощью лиофилизированных реактивов методом ПЦР с обратной транскрипцией: дис… кан. хим. наук. Спб, 2015.
14. Херсонская А.М., Амон Е.П. Типовые ошибки при диагностике методом ПЦР // Справочник заведующего КДЛ. – 2010. – №5 – С.30-36
15. Шибаева А.В., Айвазова Р.А., Ребриков Д.В. и др. Применение метода ПЦР в реальном времени для изучения микробиома пародонта у пациентов с сочетанной патологией гастродуоденальной зоны и хроническим пародонтитом. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.– 2016. – № 01. – С. 26-29
16. REAL-TIME ПЦР [электронный ресурс] // Режим доступа: http://sente-lab.com/novinki-iz-laboratornogo-mira/real-time-pczr.html/. Дата обращения: 12.10.2019.